怎样从primer-blast里选择合适的引物

怎样从primer-blast里选择合适的引物

从NCBI的primer blast里设计出的引物往往有很多对，但并不是每一对都有效，选择有效的引物有一些原则。

首先一定要确保“Exon junction span”选项设置为“primer must span an exon-exon junction”,这是为了排除DNA污染。

产物长度一般设置为90-180为较好。

Tm值要在60℃左右，且正反引物的值要接近，不能差太远。

GC含量也要接近，不能差太多，一般在45%-55%之间较好。

自我配对不能太高。

越靠前越好，一般在前三对里选。

怎样看某对引物能不能检测出其它相似基因：在两条引物中，针对其他基因，一条引物突变碱基数大于等于3，另一条引物突变碱基数大于等于2，就不会PCR出其他基因。

最后进行PCR验证，能P出相应长度的条带就是有效的引物。